郴州医学高等专科学校(423000) 陈晓岚1 黄仁彬2 许名宗 欧阳驰 周少平
目的:观察二十二碳六烯酸(DHA) 对神经细胞生长发育的影响。方法:将无血清培养的新生大鼠大脑神
经细胞分为实验组和对照组,实验组加入0. 33mol/ L 乳化DHA40μl 。对两组细胞进行形态学观察及蛋白质
含量测定。结果:实验组大脑神经细胞的突起生长速度、胞体面积和直径、神经细胞存活率及蛋白质含量均显
著高于对照组。结论:DHA 对神经细胞的生长有促进作用,这一作用可能与促进神经细胞蛋白质合成有关。
关键词 二十二碳六烯酸 生长发育 神经细胞
分类号 R329. 2 + 6
EFFECTS OF DHA ON GROWTH AND DEVELOPMENT OF
NEWBORN RAT CEREBRAL NEURONS
Chen Xiaolan , Huang Renbin , Xu Minzong , et al .
Chenzhou Medical Collage , Chenzhou 423000
[ Abstract] Objective :To determine the effects of DHA on the growth and development of cerebral neurons.
Methods :The primary culture of the cerebral neurons of newborn rats was carried out in vitro by using serum - free
medium. Cells were divided into two groups , experimental and control. DHA was added to the medium in the ex2
perimental group. After the neurons were cultured , the morphological states of the neurons were investigated ; the
protein content of the neurons were measured. Results :In the presence of DHA , both the number of survival cells
and the outgrouth neurites as well as the diameter and volume of neurons and the content of protein were markedly
increased in image analysis. Conclusion : It is suggested that DHA may play a promotive role in the growth and de2
velopment of cerebral neurons.
Key words :DHA ; Growth ;Development ;Neurons
近年来n - 3 多不饱和脂肪酸( PUFA) 在智力发育和视力中的作用受到广泛关注[1 ,2 ] 。现已发现脑和视网膜磷脂中DHA 含量非常高,是结构脂的重要组成成分。动物实验和早产儿补充喂养实验已经证实,充足的DHA 对于视觉、认知、记忆及辨别性学习能力有重要作用[3 ] ,这是否与其促进神经细胞的生长有关尚不清楚。本研究以新生大鼠大脑神经细胞原代单层无血清培养为模型,观察DHA 对大脑神经细胞发育的作用。
1 材料与方法
1. 1 无血清培养液
在神经基础培养液内,补充1 %N2 ,2 %B27 (按Gibco 公司产品说明补充) ,青霉素100ku/ L ,链霉素100mg/ L ,谷氨酰胺100mg/ L 。
1. 2 神经细胞培养
取当天出生的Wister 大鼠断头取脑,分离出双侧大脑半球, 用0. 125 %胰蛋白酶消化( 37 ℃,30min) 分散,制成细胞悬液。以0. 4 %台盼兰染色计数活细胞(细胞密度约1 ×106 个/ ml) ;接种于涂有多聚赖氨酸的35mm 培养皿中,每皿2ml ,再加入无血清培养液后,置于36 ℃、10 %CO2 的培养箱内培养。24h 换全液, 以后每周换2 次, 每次换液50 %。
1. 3 DHA 剂量分组
将DHA 标准液(为Sigma 公司产品) 乳化并配制成DHA0. 33mol/ L 储备液,除菌后置- 20 ℃冰箱备用。将神经细胞分为7 组,1 组为空白对照组;2组为12. 5μmol/ L 组(加DHA 储备液10μl) ;3 组为25μmol/ L 组(加DHA 储备液20μl) ;4 组为50μmol/L 组(加DHA 储备液40μl) ; 5 组为100μmol/ L 组(加DHA 储备液80μl) ; 6 组为150μmol/ L 组(加DHA 储备液120μl) ;7 组为200μmol/ L 组(加DHA储备液160μ1) 。
1. 4 神经细胞突起计数和突起长度测量
每天定时在倒置相差显微镜( ×400) 下观察各组神经细胞的生长情况。将培养16h 的神经细胞用戊二醛固定,随机计数50 个视野内神经细胞突起的数目;随机测量100 个突起长度,取均值作比较。所测细胞均有明显光晕、长有突起。
1. 5 神经细胞胞体长径、短径及胞体面积的测量
分别于第3 ,7 ,14 ,21 及28 天终止培养,戊二醛固定后,苏木精染色,随机选择视野,在计算机图像分析仪上各测定30 个神经细胞的胞体长、短径及面积。
1. 6 神经细胞存活数的观察
分别于第3 ,7 ,14 ,21 及28 天终止培养,戊二醛固定后,在倒置相差显微镜下随机选择50 个视野,对有明显光晕、胞核清晰、生长状态良好的神经细胞进行计数。
1. 7 神经细胞蛋白质测定
取培养第14 天的神经细胞,根据Bradford 建立的染料- 蛋白质结合法[4 ]进行测定。
2 结果
2. 1 不同浓度的DHA 对新生大鼠大脑神经细胞突起生长的影响
接种培养16h 后,大部分神经细胞贴壁生长,一些长出突起,实验组神经细胞突起数目多且长,对照组突起数目少且短小。比较不同浓度DHA 对神经细胞突起生长的影响,DHA 浓度为12. 5μmol/ L 时,对大脑神经细胞突起无明显促生长作用,培养液中加入25～100μmol/ L DHA 时,对大脑神经细胞突起均有明显促生长作用,其中尤以50μmol/ L DHA 的促生长作用最为明显; 但当DHA 浓度增至150～200μmol/ L 时,对其生长反而起抑制作用,并影响神经细胞的贴壁存活。因此,大脑神经细胞培养基中DHA 的适宜浓度为50μmol/ L (见图1) 。
2. 2 DHA 对新生大鼠大脑神经细胞胞体的影响
自培养7d 以后到28d ,实验组(DHA 浓度为50μmol/ L) 神经细胞胞体面积、长径和短径均大于对照组,两组之间差别有极显著意义(见表1) 。
2. 3 DHA 对新生大鼠大脑神经细胞体外存活的影响
神经细胞培养过程中,7d 以前的神经细胞发育快、死亡少。实验组神经细胞存活数普遍高于对照组。培养14d 的神经细胞胞体迅速长大,少部分神经细胞退化死亡。14～21d 神经细胞形态处于相对稳定状态,存活数变化不大,此期间实验组神经细胞存活数仍普遍高于对照组。培养至28d ,对照组大部分神经细胞退化死亡,细胞存活数明显不降,而实验组神经细胞有较高存活数,神经细胞生长状态良好,两组比较差异有显著意义( P < 0. 01) ,见图2 。
图2 DHA 对神经细胞存活数的影响
2. 4 DHA 对新生大鼠大脑神经细胞蛋白质合成的影响
测定结果显示实验组大脑神经细胞蛋白质含量明显高于对照组( P < 0. 01) ,见表2 。
3 讨论
DHA 与智力发育和视力的关系是目前神经发育生物学和营养学研究的一个热点。众所周知,不同器官、组织和细胞及细胞器的生物膜磷脂含有各自特异的脂肪酸构成,这可能是不同生物膜具有其独特功能的原因之一。脑和视网膜的独特功能即依赖于其具有独特的化学组成。现己证实,DHA 为脑与视网膜中的主要不饱和脂肪酸,充足的DHA 是保证上述组织功能维持正常的重要前提[5 ] 。多种动物实验表明,在生长发育阶段,摄食低水平的18 :3n - 3 脂肪酸会使脑和视网膜中的DHA 降低[6 ,7 ] ,而DHA 水平降低会伴发视网膜功能受损、视敏度发育迟缓及某些行为改变,如能动性、活动性和学习与认知能力方面的改变[2 ] 。但这种改变是否与其改变了神经细胞的生长或脑功能有关, 尚未清楚[8 ,9 ] 。
本研究在细胞水平通过对神经细胞生长状况、细胞和突起数目、胞体大小等指标的观察和测量,研究DHA 对神经细胞生长发育的影响。结果表明:DHA 对体外培养的神经细胞生长发育有明显的促进作用,且这种促进作用与DHA 剂量有关,适量DHA 可促进神经细胞生长发育,过量DHA 则起相反作用。
本研究中神经细胞培养至第28 天时,实验组细胞存活数明显高于对照组( P < 0. 01) ,说明DHA 能明显延长神经细胞的寿命,延缓其衰老,进而为神经细胞能较长时间地发挥其调节功能提供了可靠性。
本研究中还观察到实验组神经细胞的蛋白质含量高于对照组,这一结果提示DHA 对神经细胞的促生长作用可能与其促进神经细胞的蛋白质合成有关。本研究结果与以往体内研究结果一致,更进一步说明DHA 在脑细胞生长发育中具有不可或缺的重要作用。
参 考 文 献
1 Reisbick S , Neuringer M , Hasnain R , et al. Polydipsia in rhesusmonkeys deficient in omega - 3 fatty acids [ J ] . Physiol Behav ,1992 ;47 :315～323
2 Carlson SE. The role of PUFA in infant nutrition [ J ] . Inform ,1995 ; 6 : 940～946
